附件5

水产品中氯霉素的快速检测

胶体金免疫层析法

（KJ201905）

范围

本方法规定了水产品中氯霉素的胶体金免疫层析快速检测方法。

本方法适用于水产品中氯霉素的快速测定。

原理

本方法的测定以竞争抑制免疫层析原理为基础。样品中的氯霉素经有机试剂提取，固相萃取小柱净化，浓缩复溶后，氯霉素与胶体金标记的特异性单克隆抗体结合，抑制了抗体和微孔膜检测线（T线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。通过检测线与控制线颜色深浅比较，对样品中氯霉素含量进行定性判定。

试剂和材料

除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为

GB/T

6682

规定的二级水。

3.1

试剂

3.1.1

正己烷。

3.1.2

丙酮。

3.1.3

乙酸乙酯。

3.1.4乙腈

3.1.5磷酸二氢钠，NaH2PO4·2H2O。

3.1.6磷酸氢二钠，Na2HPO4·12H2O。

3.1.7

氯化钠

3.1.8

复溶液：称取0.12

g磷酸二氢钠

(3.1.5)置于100

mL容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，制成溶液A；称取磷酸氢二钠7.16

g

(3.1.6)置于100

mL容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，制成溶液B。取溶液A

2.8

mL、溶液B

7.2

mL、氯化钠(3.1.7)0.85

g，用水溶解并稀释至100

mL，得磷酸盐缓冲液，即为复溶液。

3.1.9丙酮-正己烷（1+9）：丙酮（3.1.2）、正己烷（3.1.1）按体积比1：9混匀。

3.1.10丙酮-正己烷（6+4）：丙酮（3.1.2）、正己烷（3.1.1）按体积比6：4混匀。

3.2

标准物质

氯霉素标准物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分之式、相对分子质量见表1，纯度≥98.6%。

表1

氯霉素参考物质中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量

中文名称

英文名称

CAS登录号

分子式

相对分子量

氯霉素

Chloramphenicol

56-75-7

C11H12Cl2N2O5

323.13

注：或等同可溯源物质。

3.3标准溶液配制

3.3.1

氯霉素标准储备液（1

mg/mL）：精密称取氯霉素标准物质（3.2）10

mg，置于10

mL容量瓶中，用乙腈（3.1.4）溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为1

mg/mL的氯霉素标准储备液。4℃避光保存，有效期6个月。

3.3.2

氯霉素标准中间液A（10

μg/mL）：精密量取氯霉素标准储备液（1

mg/mL）（3.3.1）0.1

mL，置于10

mL

容量瓶中，用乙腈（3.1.4）稀释至刻度，摇匀，制成10

μg/mL的氯霉素标准中间液A。4℃避光保存，有效期3个月。

3.3.3

氯霉素标准工作液（0.01

μg/mL）：精密移取氯霉素标准中间液A（10

μg/mL）（3.3.2）0.01

mL分别置于10

mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，制成浓度为0.01

μg/mL的氯霉素标准工作液。临用新配。

3.4材料

3.4.1固相萃取小柱：Cleanert

Silica，200

mg/6mL。LOT：0170198。

3.4.2免疫胶体金试剂盒（在2～30℃、干燥阴凉条件下保存，在产品有效期内使用）。

3.4.2.1

金标微孔。

3.4.2.2

试纸条或检测卡。

仪器和设备

4.1

移液器：200

μL、1

mL和5

mL。

4.2

涡旋混合器。

4.3

离心机：转速≥4000

r/min。

4.4

电子天平：感量分别为

0.01

mg和

0.01

g。

4.5

样品浓缩仪：如有需要。

4.6

环境条件：

温度：15～25℃，相对湿度：≤60%。

5分析步骤

5.1试样制备

取具有代表性样品约500

g，充分粉碎混匀，均分成两份，分别装入洁净容器作为试样和留样，密封，标记，于常温保存。

5.2试样提取和净化

准确称取试样6

g（精确至0.01

g）置于50

mL具塞离心管中，依次加入1

mL水和8

mL乙酸乙酯（3.1.3），涡旋提取5

min，以4000

r/min离心5

min。转移全部乙酸乙酯层于50

mL具塞离心管中，加入正己烷25

mL，氯化钠1

g涡旋混匀，4000

r/min

离心1

min，上清液待净化。5

mL丙酮-正己烷（1+9）（3.1.9）淋洗LC-Si硅胶小柱，弃去淋洗液，将待净化溶液转移到固相萃取小柱上，弃去流出液，用5

mL丙酮-正己烷（6+4）（3.1.10）洗脱，收集洗脱液，洗脱液于40℃氮气吹干，精密加入600

µL复溶液（3.1.8），涡旋混合1

min，作为待测液。

5.3

测定步骤

5.3.1

检测卡与金标微孔测定步骤

吸取150

µL样品待测液于反应微孔（3.4.2.1）中，抽吸

5～10次使混合均匀，室温温育3

min；温育结束后，将金标微孔中溶液滴加到检测卡（3.4.2.2）上的加样孔中，室温温育5～8

min，对结果进行判定。

5.3.2

试纸条与金标微孔测定步骤

吸取150

µL样品待测液于反应微孔（3.4.2.1）中，抽吸5～10次使混合均匀，室温温育3

min；温育结束后，将检测试纸条（3.4.2.2）吸水海绵端垂直向下插入反应微孔中，室温温育3

min，从微孔中取出试纸条，去掉试纸条下端的吸水海绵，并于5

min内进行结果判定。

5.3.3

检测卡测定步骤

吸取150

µL样品待测液滴加到检测卡（3.4.2.2）上的加样孔中，室温温育5～8

min，对结果进行判定。

5.4质控试验

每批样品应同时进行空白试验和加标质控试验。

5.4.1

空白试验

称取空白试样，按照5.2和5.3步骤与样品同法操作。

5.4.2

加标质控试验

准确称取空白样品6

g或适量（精确至0.01

g）置于15

mL具塞离心管中，加入180

μL氯霉素标准工作液（0.01

μg/mL）（3.3.3），使氯霉素浓度为0.3

μg/kg，一式2份，按照

5.2和5.3步骤与样品同法操作。

结果判定要求

通过对比控制线和检测线的颜色深浅进行结果判定。由于长时间放置会引起检测线颜色的变化，需在规定时间内进行结果判定。目视结果判读依据如图1所示。

6.1

无效

控制线（C线）不显色，表明不正确操作或试纸条/检测卡无效。

6.2

阳性结果

检测线（T线）不显色或检测线（T线）颜色比控制线（C线）颜色浅，表明样品中氯霉素含量高于方法检测限，判定为阳性。

6.3

阴性结果

检测线（T线）颜色比控制线（C线）颜色深或者检测线（T线）颜色与控制线（C线）颜色相当，表明样品中氯霉素含量低于方法检测限，判定为阴性。

6.4质量控制要求

空白试验测定结果应为阴性，加标质控试验测定结果应为阳性。

结论

如被测样品中氯霉素检测结果为阳性时，应采用确证方法进行确证检测。

性能指标

8.1

检测限

氯霉素为0.1

μg/kg。

8.2

灵敏度

灵敏度应≥98%。

8.3

特异性

特异性应≥90%。

8.4

假阴性率

假阴性率应≤1%。

8.5

假阳性率

假阳性率应≤10%。

注：性能指标计算方法见附录A

9其他

本方法所述试剂、试剂盒信息及操作步骤是为给方法使用者提供方便，在使用本方法时不做限定。方法使用者在使用替代试剂、试剂盒或操作步骤前，须对其进行考察，应满足本方法规定的各项性能指标。

本方法参比标准为GB/T

22338-2024

动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定

(包括所有修改单)。

附录

A

定性方法性能计算表

样品情况a

检验结果b

总数

阳性

阴性

阳性

N11

N12

N1.=N11+N12

阴性

N21

N22

N2.=N21+N22

总数

N.1=N11+N21

N.2=N12+N22

N=N1.+N2.或N.1+N.2

显著性差异(χ2)

χ2=(|N12-N21|-1)2/(N12+N21),自由度（df）=1

灵敏度（p+）

p+=N11/N1.特异性（p-）

p-=N22/N2.假阴性率(pf-)

pf-=N12/N1.=1-灵敏度

假阳性率(pf+)

pf+=N21/N2.=1-特异性

相对准确度

（N11+N22）/(N1.+N2.)

注：N:任何特定单元的结果数，第一个下标指行，第二个下标指列。例如：N11表示第一行，第一列，N1.表示所有的第一行，N.2表示所有的第二列；N12表示第一行，第二列。

a由基准方法检验得到的结果；

b由本方法检验得到的结果。灵敏度的计算使用确认后的结果。

本方法负责起草单位：山西省食品药品检验所。

验证单位：陕西省食品药品检验所、广东省药品检验所、四川省食品药品检验检测院。

主要起草人：李倩、阎安婷、陈煜、杨国伟。